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多能幹細胞凍存和複蘇方法

幹細胞凍存是幹細胞擴增傳代過程中重要的一環,但是幹細胞不同於普通細胞係,其增殖擴增過程中需要聚團生長,為保持其細胞活性,不建議單細胞傳代。而且使用血清+DMSO凍存方法,不能很好的保持細胞活性,且複蘇細胞成活率較低。這次就重點介紹幹細胞進行凍存以及解凍的標準化步驟。

本方法適用於HAKATA™ 人間充質幹細胞無血清培養基以及HAKATA™ 無血清細胞凍存液培養的細胞(同樣適用於mTesR以及E8係統培養的細胞),凍存以及複蘇前後,應當使用同一種培養基,複蘇傳代後可以更換其他培養體係。

HAKATA™ 無血清細胞凍存液是一款化學成分確定,無血清,無動物源成分,且無需程序降溫的高效凍存液。具體凍存及複蘇操作方法如下:

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1、凍存:以下操作方法以6孔板為例:

注意:如果使用mFreSR™,請將所需量的mFreSR™融化並置於冰上。

(1) HAKATA™ 無血清細胞凍存液為即拿即用,且4℃保存,凍存液拿出後應快速放回4℃;

(2)使用幹細胞消化液消化細胞;

(3)收集細胞,室溫300×g離心5分鍾;

(3)小心吸掉上清液,不要幹擾細胞團;

(4)用1ml凍存液重懸細胞,並均勻分裝到凍存管中

采用非程序降溫法,將凍存管直接放入-80℃冰箱中,凍存24h後轉移至液氮中長期保存。

2、解凍

預先包被細胞培養板,人ES和iPS細胞解凍後應立即接種到培養板中。

(1)幹細胞培養基室溫平衡15-30min,不能37℃加熱;

(2)在水浴鍋中持續晃動凍存管,37℃水浴鍋中快速解凍細胞,直至細胞完全融化;

(3)取出凍存管,用70%乙醇擦拭凍存管表麵;

(4)準備15ml離心管,預先加入5mL幹細胞培養基,將細胞懸浮液緩慢逐滴至15mL離心管中,盡量保持細胞聚團狀態。

(5)在室溫300×g離心5分鍾。

(6)吸掉上清,注意不要幹擾細胞沉澱。使用1mL多能幹細胞培養基輕輕地重懸細胞3-5次,不要破壞細胞聚團狀態。

(7)分別取0.5mL細胞懸液,均勻接種到包被好的6孔板的2個孔中,並分別補充多能幹細胞培養基至2m。

(8)置於37°C細胞培養箱中。在前後左右呈十字形搖動培養板板5次,以均勻分散細胞。

(9)每天更換培養基,並顯微鏡下觀察細胞狀。

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